Ce rapport consacré au Mexique évalue les progrès accomplis ou à faire dans la réduction de la charge polluante, la gestion des ressources naturelles, l'intégration des politiques économique et environnementale et le renforcement de la coopération internationale. Les analyses s'appuient sur un large ensemble de données économiques et environnementales.

Le but de l'essai in vitro d'aberration chromosomique est d'identifier les agents qui causent des aberrations chromosomiques structurales dans les cellules mammifères cultivées. Les aberrations structurales peuvent être de deux types : chromosomiques ou chromatidiques.

L'essai in vitro d'aberration chromosomique peut utiliser des cultures de lignées cellulaires établies, des souches cellulaires ou des cultures de cellules primaires. Des cultures cellulaires sont exposées à la substance d'essai (liquide ou solide) avec et sans activation métabolique pendant environ 1.5 fois le cycle cellulaire normal. Au moins trois concentrations analysables de la substance d'essai devraient être employées. Il faut normalement réaliser les cultures en doublon à chaque niveau de dose. À intervalles prédéterminés après exposition des cultures de cellules à la substance d'essai, les cellules sont traitées avec une substance qui bloque la métaphase, récoltées et teintées. Les cellules métaphasiques sont analysées au microscope pour déceler les aberrations chromosomiques.

L'essai in vitro de mutation génique sur des cellules de mammifères peut être employé pour détecter des mutations induites par les substances chimiques. Dans ces lignées cellulaires, les systèmes les plus couramment utilisés permettent de détecter une mutation sur les loci de la thymidine kinase (TK), de l’hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT) et d’un transgène de la xanthine-guanine phosphoribosyl transferase (XPRT). Les essais de la mutation de TK, de HPRT et de XPRT détectent différents types d’événements génétiques.

Des cellules en suspension ou en culture monocouche sont exposées à quatre concentrations analysables de la substance d'essai au moins, avec et sans activation métabolique, pendant une période appropriée. Elles sont repiquées pour déterminer la cytotoxicité et pour permettre l'expression phénotypique avant la sélection. On recommande d'utiliser au moins 106cellules. La cytotoxicité est habituellement déterminée en mesurant l'efficacité de clonage relative (survie) ou la croissance totale relative des cultures après la période de traitement. Les cultures traitées sont maintenues dans le milieu de croissance pendant une période suffisante, caractéristique de chaque locus et de chaque type cellulaire, afin de permettre l'expression phénotypique presque optimale des mutations induites. La fréquence de mutant est déterminée par l’ensemencement d’un nombre connu de cellules dans le milieu contenant l'agent sélectif pour détecter des cellules mutantes, et dans le milieu sans agent sélectif pour déterminer l'efficacité de clonage (viabilité). Après un temps approprié d'incubation, des colonies sont comptées.

L'essai de micronoyaux de mammifères est employé pour la détection des dommages induits par la substance d'essai aux chromosomes ou à l'appareil mitotique des érythroblastes, par l'analyse des érythrocytes prélevés dans la moelle et/ou les cellules du sang périphérique des animaux, habituellement des rongeurs (souris ou rats).

Le but de l'essai de micronoyaux est d'identifier des substances (liquide ou solide) qui causent des lésions cyto-génétiques et des micronoyaux dans lesquels il reste des fragments de chromosomes ou des chromosomes entiers. Une augmentation de la fréquence des érythrocytes polychromatiques micronucléés chez les animaux traités est une indication des dommages chromosomiques induits. Les animaux sont exposés à la substance d'essai par une voie d’exposition appropriée (habituellement par gavage à l'aide d'une sonde gastrique ou d'une canule de tubage adaptée, ou par injection intrapéritonéale). La moelle et/ou les cellules sanguines sont rassemblées, préparées sur des lames et colorées. Les lames sont analysées pour détecter la présence de micronoyaux. Chacun des groupes traités et de contrôle doivent inclure au moins 5 animaux analysables par sexe. L'administration des traitements se compose d'une dose unique de la substance d'essai ou de deux doses quotidiennes (ou plus). La dose limite est 2000 mg/kg pc/j pour le traitement jusqu'à 14 jours, et 1000 mg/kg pc/j pour le traitement de plus de 14 jours.

Cet essai mesure des événements chromosomiques dans les cellules germinales de spermatogonies et devrait donc prévoir l'induction de mutations héréditaires dans les cellules germinales.

Des hamsters chinois et des souris mâles sont généralement utilisés. Les animaux sont exposés à la substance d'essai (liquide ou solide) par une voie appropriée d'exposition, habituellement par gavage ou par injection intrapéritonéale. Puis, ils sont sacrifiés à des moments appropriés après traitement. Chacun des groupes traités et témoins incluent au moins cinq mâles analysables. Les substances d'essai sont de préférence administrées une ou deux fois mais elles peuvent également être administrées en prises fractionnées quand le volume à administrer est grand. Avant le sacrifice, les animaux sont traités avec un inhibiteur de fuseau. Des préparations chromosomiques sont alors faites à partir des cellules germinales puis colorées. Les aberrations chromosomiques des cellules en métaphase sont analysées. Un essai limite peut être réalisé si aucun effet n’est prévu à une dose de 2000 mg/kg pc/j. Des résultats positifs de l'essai d'aberration chromosomique sur des spermatogonies in vivo indiquent qu'une substance induit des aberrations chromosomiques dans les cellules germinales des espèces examinées.

L'essai d'aberration chromosomique in vivo sur mammifères est employé à l’identification des composés d'essai qui induisent des aberrations structurales dans des cellules de moelle osseuse d’animaux, généralement des rongeurs (rats, souris et hamsters chinois). Les aberrations structurales peuvent être de deux types : chromosomiques ou chromatidiques.

Des animaux sont exposés à la substance d'essai (liquide ou solide) par une voie d'exposition appropriée (habituellement par gavage via une sonde gastrique ou d’une canule de tubage appropriée, ou par injection intrapéritonéale) et sont sacrifiés après des délais appropriés de traitement. Avant le sacrifice, les animaux sont traités avec un inhibiteur de fuseau. Des préparations chromosomiques sont alors faites à partir des cellules de moelle et colorées, et des cellules de métaphase sont analysées pour mettre en évidence les aberrations chromosomiques. Chacun des groupes traités et de contrôle doivent inclure au moins 5 animaux analysables par sexe. La dose de limite est 2000 de mg/kg pc/jour pour le traitement jusqu'à 14 jours, et de 1000 mg/kg pc/jour pour le traitement de plus de 14 jours.

Cette Ligne directrice a été conçue pour obtenir les informations nécessaires pour confirmer ou mieux caractériser une neurotoxicité potentielle de produits chimiques chez des animaux adultes.

Cette Ligne directrice utilise le rat. Elle s'adresse spécifiquement à l'administration quotidienne par voie orale, par gavage, (dans l’alimentation, dans l’eau de boisson ou dans des gélules) de la substance d'essai. Quand l'étude est entreprise comme une étude séparée, au moins 20 animaux (10 femelles et 10 mâles) devrait être employés dans chaque dose. Au moins trois groupes traités et un groupe de contrôle devraient généralement être employés. Des niveaux de dose devraient être choisis en prenant en considération toute toxicité précédemment observée et toutes données cinétiques disponibles pour la substance d'essai. Le régime de dosage peut être de 28 jours, 90 jours (subchronique) ou 1 an ou plus (chronique). Les procédures visées dans cette Ligne directrice peuvent également être employées pour une étude aiguë de neurotoxicité. L'essai de limite correspond à un niveau de dose d’au moins 1000 mg/kg pc. Les résultats de cette étude incluent des mesures (pesée, consommation d’eau et de nourriture), des essais fonctionnels, et des observations, au moins quotidiennes, détaillées (ophtalmologie, hématologie, biochimie clinique et histopathologie). Au moins cinq mâles et cinq femelles, choisis parmi le groupe d'essai, devraient être perfusés in situ et utilisés pour la neurohistopathologie détaillée à la fin de l'étude. Les résultats de l'étude doivent être évalués en termes d'incidence, sévérité et corrélation des effets sur le comportement et neuropathologiques (également des effets neurochimiques ou électrophysiologiques si des examens supplémentaires sont inclus) et de tous les autres effets nuisibles observés.

Le but de l'essai synthèse non programmée de d'ADN (UDS) sur les cellules de foie de mammifères in vivo est d'identifier les substances qui induisent la réparation de l'ADN après excision et élimination d'un segment d'ADN contenant la région endommagée par l'agent physique ou chimique (solides ou liquides).

L'essai est habituellement basé sur l'incorporation de thymidine tritiée, 3H-TdR, (pendant 3-8 heures) dans l'ADN des hépatocytes qui ont peu fréquemment des cellules en phase S du cycle de cellules. L’incorporation de 3H-TdR est habituellement déterminée par autoradiographie. Les rats sont généralement utilisés, et au moins trois animaux analysables par groupe sont utilisés. Normalement, au moins deux niveaux de dose sont employés. Un essai limite peut être réalisé si aucun effet n’est prévu à une dose de 2000 mg/kg pc/j. La substance d’essai est généralement administrée comme traitement unique par gavage en utilisant une sonde gastrique ou une canule d'intubation appropriée. Des hépatocytes sont prélevés sur des animaux traités 12-16 heures après l’administration du produit. Après l'autoradiographie, normalement 100 cellules sont comptées par animal sur au moins deux lames. Un résultat positif de l'essai d'UDS avec les cellules de foie mammifères indique in vivo qu'une substance induit des dommages d'ADN en cellules de foie mammifères in vivo qui peuvent être réparées par la synthèse imprévue d'ADN in vitro. Un résultat négatif indique que, dans les conditions d'essai, la substance d'essai n'induit pas des dommages d'ADN qui sont discernables par cet essai.

Cette Ligne directrice décrit une procédure pour déterminer le potentiel de bioconcentration de substances dans les poissons, en régime d’écoulement continu (mais les régimes semi-statiques sont acceptables).

L'essai se compose de deux phases : l'exposition (absorption) et phases post-exposition (élimination). Pendant la phase d’absorption (28 jours normalement et maximum de 60 jours), des groupes séparés de quatre poissons d’une espèce sont exposés à au moins deux concentrations de la substance d'essai. Ils sont alors transférés à un milieu exempt de la substance d'essai pour la phase d’élimination. Une phase d’élimination est toujours nécessaire à moins que l’absorption de la substance pendant la première phase soit négligeable. En plus des deux concentrations d'essai, un groupe de contrôle de poissons est maintenu sans substance d'essai. La concentration de la substance d'essai dans/sur les poissons est suivie pendant les deux phases de l'essai. Pendant l'essai, l'oxygène dissous, le carbone organique total, le pH, la dureté et la salinité totale, et la température sont mesurés dans les récipients. La teneur en lipides et la concentration de la substance d'essai sont déterminées, si possible, sur le même matériel biologique. Dans la mesure du possible, le facteur de bioconcentration à l’état stationnaire apparent (BCF), exprimé en fonction du poids humide total des poissons, et le facteur de bioconcentration cinétique (BCFK) sont calculés. La bioconcentration est exprimée par rapport au contenu de lipide en plus du poids de corps entier.

Cette Ligne directrice décrit la chromatographie sur gel perméable (CPG). Cette méthode permet de déterminer la distribution des masses moléculaires et les masses moléculaires moyennes (Mn, Mw). La CPG est un type particulier de chromatographie liquide dans lequel l'échantillon est séparé selon les volumes hydrodynamiques des différents constituants.

Selon leur taille, les molécules éluées peuvent ou non pénétrer dans le matériel poreux (typiquement un gel organique) dont les colonnes sont remplies. Ainsi, les plus petites molécules sont retenues tandis que les plus grandes s'éluent plus rapidement. À la sortie de la colonne, les détecteurs (généralement par réfractométrie différentielle) fournissent l'indice de réfraction ou l'absorption dans l’UV et donnent une courbe de répartition simple. Cependant, pour attribuer des valeurs réelles de poids moléculaire à la courbe, il est nécessaire de calibrer la colonne l’élution de polymères de poids moléculaires connus et, idéalement, de structure semblable, par exemple divers polystyrènes étalons. Pour chaque échantillon analysé, deux expériences indépendantes doivent être réalisées. Elles doivent être analysées individuellement. Les paramètres Mn, Mw, Mw/Mn doivent être déterminés pour chaque mesure.

Cette Ligne directrice décrit la chromatographie sur gel perméable (CGP). Cette méthode permet de déterminer la distribution des masses moléculaires et les masses moléculaires moyennes (Mn, Mw). La CGP est un type particulier de chromatographie liquide dans lequel l'échantillon est séparé selon les volumes hydrodynamiques des différents constituants. On définit arbitrairement une masse moléculaire faible comme étant une masse moléculaire inférieure à 1000 daltons.

Selon leur taille, les molécules éluées peuvent ou non pénétrer dans le matériel poreux (typiquement un gel organique) dont les colonnes sont remplies. Ainsi, les plus petites molécules sont retenues tandis que les plus grandes s'éluent plus rapidement. À la sortie de la colonne, les détecteurs (généralement par réfractométrie différentielle) fournissent l'indice de réfraction ou l'absorption dans l’UV et donnent une courbe de répartition simple. Cependant, pour attribuer des valeurs réelles de poids moléculaire à la courbe, il est nécessaire de calibrer la colonne l’élution de polymères de poids moléculaire connu et, idéalement, de structure semblable, par exemple divers polystyrènes étalons. Pour chaque échantillon analysé, deux expériences indépendantes doivent être menées.

La substance d’essai est administrée par doses graduées à plusieurs groupes de mâles et de femelles. Les mâles doivent être traités pendant au moins quatre semaines ; les femelles doivent être traitées tout au long de l’étude (approximativement 54 jours). Normalement des accouplements « un mâle pour une femelle » doivent être employés dans cette étude.

Cette Ligne directrice utilise le rat. Il est recommandé que la substance d’essai soit administrée oralement par gavage. Ceci devrait être fait avec une dose unique quotidienne en utilisant une sonde gastrique ou une canule d'intubation appropriée. Chaque groupe devrait initialement inclure au moins 10 animaux de chaque sexe. Généralement, au moins trois groupes d'essai et un groupe de contrôle devraient être employés. Des niveaux de dose devraient être choisis, en tenant compte de toutes données de toxicité existantes et de (toxico-) cinétique disponibles. L'essai limite correspond à un niveau de dose d’au moins de 1000 mg/kg de poids corporel. Les résultats de cette étude incluent des mesures (pesée, consommation de nourriture/eau) et observations quotidiennes détaillées (y compris la réactivité sensorielle aux stimulus), de préférence chaque jour au même moment, de même qu’une autopsie générale et l'histopathologie. Les résultats de cette étude de toxicité devraient être évalués en termes d'effets observés, autopsie et résultats microscopiques. L'évaluation inclura le rapport entre la dose de la substance d'essai et la présence ou l'absence d’observations. En raison de la période courte du traitement du mâle, l'histopathologie du testicule et l'épididyme doivent être pris en compte avec les données de fertilité, lors de l’évaluation des effets reproducteurs mâles.